《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated “one-pot”dual detection assay for genetically modified crops》

转基因作物已在世界各地广泛种植，许多国家逐步完善转基因监管措施以确保转基因作物的安全。开发快速和准确的基因现场检测方法对农业和生物安全非常重要，可以减轻公众对转基因产品的担心。

在本研究中，课题组开发了一种新的一锅法反应——双重MIRA检测结合双重CRISPR（MR-DCA方法），用于同时检测转基因作物中的CaMV35S和NOS遗传靶点，为转基因作物的检测提供了一种简单高效的检测方法。

实验方法

将双重MIRA产物用双Cas13a、Cas12a系统进行分析，产生两个互不干扰的独立信号，再通过照明仪器读取荧光颜色，或通过带有两条T线的试纸条，以实现双通道读出。整个过程在不到35 min的时间内完成，检测限低至20个拷贝。

（MR-DCA检测CaMV35S和NOS的原理）

整个实验分为3个步骤：MIRA扩增、CRISPR反应、2种方式的结果判读。

CaMV35S基因作为Cas13a的靶标，NOS基因作为Cas12a的靶标，分别设计了两对MIRA引物。Cas13a系统只识别RNA，因此设计了正向引物区域，包含一个T7启动子，用于后续转录，激活Cas13a。为NOS基因增加一个PAM 。以上的这些的添加确保了Cas13a和Cas12a蛋白都可以与各自的crRNA结合，且两个系统之间不存在干扰或交叉反应。

实验情况

l 灵敏度和特异性

将样本梯度稀释来测试MIRA反应的荧光强度，发现样本浓度在20μL时仍能检测到荧光强度，最终实验选定20μL的浓度。

（不同样本浓度和试纸条显色测试并用强度量化计算）

为了进一步评价MR-DCA的特异性，课题组对非转基因动物混合样品和非转基因植物混合样品进行了检测。结果显示只有含有CaMV35S和NOS的转基因样品具有较高的荧光信号，而其他样品的荧光强度与阴性对照比较接近。MR-DCA可作为一种特定的双靶点核酸检测平台。

用MR-DCA对24个作物样品进行了测试。 其中1、2、15、16、21、22是含有CaMV35S启动子的转基因玉米。7、8、23、24是含有NOS终止子的抗病转基因水稻。3、4、11、12、13、14、17、18是含有CaMV35S启动子和NOS终止子转基因大豆。

（24个样本的检测结果）

l反应快速

反应时间是现场检测的一个重要因素，课题组观察到在反应时间为10 min时，就已经能用荧光仪检测到FAM和HEX的荧光信号。MIRA结合CRISPR反应，也在15min后观察到黄色荧光。

（不同MIRA反应时间下的荧光信号）

（MIRA反应不同时间下的试纸条显色并用强度量化计算）

l 实验结论

实验结果表明，该双重MIRA具有良好的特异性，并能准确地获得CaMV35S和NOS的扩增产物，Cas13a和Cas12a系统独立反应，互不干扰。MR-DCA检测能在35min的低温下准确检测到20个拷贝，具有在田间检测转基因作物的巨大价值。

文章信息

期刊名称：《Journal of Advanced Research》

文章标题：《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated “one-pot”dual detection assay for genetically modified crops》

影响因子：11.4

研究团队：浙江省农业科学院汪小福

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