《基于CRISPR Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法》

张敏琳, 黄枫淇, 左小玲, 梁建韬, 梁凯珊, 单金红, 李宗烊, 喻婕, 罗丽媛, 禤梓杰, 赵会宏, 王庆. 

基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法[J]. 水生生物学报, 2024, 48(2): 283-291. DOI: 10.7541/2023.2023.0199

大口黑鲈（Micropterus salmoides），也叫加州鲈或美国黑鲈，是一种原产于北美的淡水鱼类，近年来在全球范围内成为一种重要的养殖鱼类，因其市场需求高：大口黑鲈肉质紧实、刺少，味道鲜美，营养丰富，尤其富含高蛋白和低脂肪，符合消费者对健康食品的需求，因此市场售价较高，常用于高端餐饮市场。生长快：大口黑鲈生长速度较快，一般6-8个月可以达到商品规格，适合短周期养殖，能快速实现投资回报。抗病力强：相较于其他养殖鱼类，大口黑鲈对环境适应能力强，较少爆发大规模疾病，降低了养殖风险。生态养殖：大口黑鲈可以与其他淡水鱼类如鲢鱼、草鱼等混养，有助于实现池塘生态平衡和资源利用最大化，进一步提高养殖效益等因素，受到食客们与水产养殖户们的欢迎，近年来其养殖规模快速增长。

弹状病毒科

大口黑鲈虽然较为抗病，但在不良养殖环境下仍可能患上一些疾病，其中大口黑鲈弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV）危害巨大：最早于1991年在美国佛罗里达州被发现，该病毒最初是在野生大口黑鲈群体中检测到，随后逐渐在美国的多个淡水湖泊和水库中传播开来，成为大口黑鲈的主要病原之一。

透射电镜下观察病变细胞中的病毒粒子的形态大小

章文言，张玉军，李陈，等.大口黑鲈弹状病毒的分离与鉴定［J］.华中农业大学学报，2022，41（6）：230‐236.

ZHANG Wenyan,ZHANG Yujun,LI Chen,et al.Isolation and identification of Micropterus salmoides rhabdovirus[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2022,41(06):230-236.

传播源常为受感染的鱼苗或成鱼、受污染的水体、以及携带病毒的野生鱼类；这种病毒可以通过直接接触、粪便排泄、以及水体传播，在不良水质或高密度养殖条件下更易扩散。该病毒能引起幼鱼嗜睡、漫游、腹部肿胀和体形扭曲, 以及诱导坏死性溃疡和多器官出血, 一旦感染死亡率超过 90%。’

人工感染后大口黑鲈的临床症状

章文言，张玉军，李陈，等.大口黑鲈弹状病毒的分离与鉴定［J］.华中农业大学学报，2022，41（6）：230‐236.

ZHANG Wenyan,ZHANG Yujun,LI Chen,et al.Isolation and identification of Micropterus salmoides rhabdovirus[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2022,41(06):230-236.

每年因MSRV导致的大口黑鲈鱼苗损失超过30%, 目前关于该病毒的治疗与检测方法还不成熟, 并没有特效药可以医治，故很有必要在感染之前及时发现病毒并做好有效的防范措施, 能够在一定程度上减少养殖过程中的损失；

此外现有检测技术较难做到在无复杂检测设备的情况下开展现场检测，面对这一挑战，华南农业大学的研究团队开发出了一种MIRA结合CRISPR-系统的全新检测方法，该方法特异性强, 灵敏度高并且操作简便, 极大提升了MSRV的检测效率，也为尽早发现MSRV采取防控措施提供帮助。

K8凯发国际生物·成品科研试剂：大口黑鲈弹状病毒恒温检测试纸条型试剂盒

文章所用产品：RNA恒温快速扩增试剂盒（基础型）-II

MIRA引物对筛选

使用两对不同MIRA引物对含有靶序列的基因片段进行扩增, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳。电泳图位于100 bp的位置, 3个泳道均出现明亮的条带, 表明有非特异性扩增产物。泳道2和3中250 bp处为扩增的目的条带。用Image J软件分别将电泳图泳道2中长度为224 bp和泳道3中长度为255 bp的目的条带进行定量分析, 并用“灰度值”表示定量分析的结果。从分析结果得出, 灰度值越低表示引物利用率高, 即引物特异性结合扩增效率高。

结果表明: 采用MIRA-F2/R2引物对时, 特异性结合扩增效率高。

MIRA引物对筛选电泳胶图以及灰度值分析

a. 泳道M: 2000 bp DNA marker; 泳道1. 阴性DNA样品扩增; 泳道2. MIRA-F1/R1引物对扩增目的片段(方框所示224 bp);

 泳道3. MIRA-F2/R2引物对扩增目的片段(方框所示255 bp); b. 条带灰度值分析(方框所示)

CRISPR/Cas13a检测体系

CRISPR/Cas13a检测体系反应结束后用紫外灯进行照射, 观察结果。

CRISPR/Cas13a-MSRV最佳反应体系

K8凯发国际分别用RNA标准品和扩增的样品RNA进行实验,靶向目标RNA的定位速度, crRNA2要优于crRNA1; crRNA1比crRNA2有更强的最终荧光信号; crRNA1+crRNA2等比例混合使用能综合两者的优点, 反应效率更好。 

a. 用不同间隔序列的crRNA检测标准品RNA的检测结果比较; b. 检测系统在不同温度下检测标准品RNA的荧光信号数据比较; 

c. 用不同浓度的RNA报告探针检测标准品的荧光信号数据比较; d. 用不同浓度比率的Cas13a/crRNA探针复合物检测标准品的检测结果比较；

探究反应温度对检测系统的影响, 设置了31℃、34℃、37℃和41℃不同反应温度, CRISPR/Cas13a-MSRV检测体系最佳反应温度是37℃。 

探究ssRNA报告探针浓度对检测系统的影响, 在测试范围内, 荧光强度与ssRNA报告探针浓度呈正相关, ssRNA报告探针浓度在 500-700 nmol/L检测效果差异不大, 考虑到现实经济问题, 最佳的ssRNA报告探针浓度为500 nmol/L。 

为探究不同Cas13a与crRNA的反应浓度比对检测系统的影响, 当以每份100 nmol/L比例的基础上，Cas13a﹕crRNA的比例为4﹕1和3﹕1时, Cas13a达到饱和状态; 当Cas13a数量一定时, 荧光信号的强度并没有与crRNA数量的增加呈正相关。因此, Cas13a与crRNA比例为2﹕1时, CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统能够获得最大的检测活性。 

灵敏度评估

为探究CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统对MSRV的最低检测浓度, 故将RNA标准品进行10倍梯度连续稀释, 并用CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统进行检测。 CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统至少能检测到102 fM MSRV的目标RNA。当目标RNA浓度低于102 fM时, 机器检测到的荧光信号与空白对照无明显差异。因此, CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统至少能检测到102 fM MSRV的ssRNA。 

 评估CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统对MSRV的灵敏度

特异性评估

为评估CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统的特异性, 使用优化后的CRISPR/Cas13a检测系统检测不同的水产RNA病毒, 包括RGNNV、BFNNV和TPNNV。只有MSRV的检测体系能检测出荧光信号, 其他病毒的检测体系检测出的荧光信号与阴性对照无差别, 为阴性结果。这表明CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统可特异性靶向MSRV, 该检测方法特异性很好。 

评估CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统对MSRV的特异性

样品检测

对从鲈鱼养殖场采集有明显患病迹象的病鱼样品, 验证病鱼所感染病原体是否为MSRV, 使用MSRV衣壳蛋白序列特异性引物进行PCR扩增, 电泳图中相对应条带送测, 比对确认为MSRV。 

对感染了MSRV的病鱼样品进行预处理和预扩增病毒RNA, 然后与阴性对照组进行检测。同时提取样品的cDNA做常规检测qPCR进行比较。 用CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统检测出阳性样品(3、6、7、8、9、12、13、14和15号)与常规检测qPCR的结果一样, 其中qPCR的CQ值处于18-25; 而阴性样品(1、2、4、5、9、10和11号)阈值循环数则都大于38, 表明样品无携带MSVR病毒。综上所述, CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统与常规检测RT-qPCR的检测数据相符合, 表明CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统的可行性且在一定程度上可以代替原先常规繁杂的检测方法。 

a. qPCR检测MSRV临床样品阈值循环数图; 将检测到的样本循环数分别与阴性参照循环数用T-tests 分析(**P<0.01);

 b. Cas13a结合MIRA检测MSRV临床样品荧光图; 将检测到的样本荧光值分别与阴性参照荧光值用T-tests分析(**P<0.01)

综上所述, 本研究建立的CRISPR/Cas13a-MSRV检测方法不需要昂贵的实验仪器, 可使现场检测变得快速、准确且方便。因此, 在实际养殖过程中如果采用该种检测方法对MSRV进行及时的发现, 并采取针对性的有效措施, 这在很大程度上能够减少养殖过程中病害带来的损失, 并且该检测方法快捷、灵敏度高、特异性高, 具有较大的应用和推广前景。

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