草虾是我国淡水养殖业中的一种重要经济物种，但近年来，寄生于其肝胰腺的肝肠胞虫严重影响了其养殖产业。由于目前没有有效的药物或疫苗可以治疗该病，快速而精准的检测对于防止病害传播至关重要。

EHP孢子扫描电镜观察结果A.放大9.0×10³倍; B.放大5.0×10⁴倍.

乔毅, 沈辉, 万夕和, 范贤平, 蒋葛, 黎慧, 王李宝, 史文军, 成婕. 南美白对虾肝肠胞虫的分离及形态学观察. 中国水产科学, 2018, 25(5): 1051-1058. DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17430.

肝肠胞虫的检测主要依赖于分子生物学方法，其中最常见的是PCR技术。然而，PCR技术虽然灵敏度高，但需要昂贵的PCR仪器和专业的实验室环境，且操作复杂，不适合现场使用。为了解决这一问题，研究团队开发了两种基于MIRA技术的快速检测方法，这些方法具有高灵敏度、快速反应和易操作的特点，能够在现场不需要复杂实验设备的情况下，对虾体中的肝肠胞虫进行高效、快速的检测，填补了现有检测方法不足的空缺。

文章所用的扩增试剂：DNA恒温快速扩增试剂盒（基础型）与DNA 恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）

MIRA技术是一种多酶恒温快速核酸扩增技术。其核心原理是通过多种功能蛋白在常温下协同作用，实现核酸的快速扩增，是能够真正实现便携式的现场快速核酸检测的技术。

研究方法

样本提取

研究团队从辽宁省的三个虾养殖场收集了感染和健康的草虾样本，并提取了草虾的肝胰腺DNA。

引物设计

针对肝肠胞虫的S8丝氨酸蛋白基因（基因库登录号：ON 182063），设计了三对MIRA引物。该基因具有独特的活性位点，能够保证检测的特异性。

MIRA-AGE与MIRA-LFD检测

(A) 优化RPA-AGE反应温度。M：DL 500标记物；N：阴性对照；分别为品系1-5：25°C、30°C、37°C、39°C和42°C。

(B) 优化RPA-AGE反应时间。M：DL 500标记物；N：阴性对照；1：10 min；2：20 min；3： 30 min；4： 40 min。

(C) 优化RPA-LFD反应温度。N：阴性对照；1：25°C；2：30°C；3：37°C；4：39°C；5：42°C。

(D) 优化RPA-LFD反应时间。N：阴性对照；1：5 min；2：10 min；3：20 min。

两种MIRA检测方法分别通过琼脂糖凝胶电泳（MIRA-AGE）和胶体金侧流免疫层析法（MIRA-LFD）实现检测。研究团队通过实验优化了反应温度和时间。MIRA-AGE在37°C下进行30分钟扩增，而MIRA-LFD则在37°C下仅需10分钟即可完成扩增，5分钟内即可读取结果。

实验结果

特异性与灵敏度

(A) RPA-AGE检测的特异性。M：DL 1000标记物；P：蒿型肠孢菌；1：肝减少肠细胞；2：肝孢菌；3：微孢子虫；4：白斑综合征病毒；6：异常威克汉姆酵母；N：阴性对照。

(B) RPA-LFD检测的特异性。P：蒿型肠孢菌；N：阴性对照；1：肝减少肠细胞；2：肝孢菌；3：微孢子虫；4：白斑综合征病毒；6：异常威克汉姆酵母。

(C) RPA-AGE对重组质粒梯度稀释的敏感性。M： DL 500标记；N：阴性对照；1： 4.7×10^5拷贝/µL；2： 4.7×10^4拷贝/µL；3： 4.7×10^3拷贝/µL；4： 4.7×10^2拷贝/µL；5： 4.7×10拷贝/µL；6： 4.7拷贝/µL。

(D)  RPA-LFD对重组质粒梯度稀释的敏感性。N：阴性对照；1： 4.7×10^5拷贝/µL；2： 4.7×10^4拷贝/µL；3： 4.7×10^3拷贝/µL；4： 4.7×10^2拷贝/µL；5： 4.7×10拷贝/µL；和6： 4.7拷贝/µL。

实验显示，MIRA技术具有高度特异性，能够准确检测出肝肠胞虫，而对其他病原体无反应。灵敏度方面，两种方法的检测下限均为4.7copies/µL，显著高于传统PCR检测的灵敏度。

临床样本检测

对30个临床样本的检测结果显示，MIRA-AGE与MIRA-LFD的阳性率均为70%，略低于qPCR80%的阳性率，但远高于传统PCR的56.7%的阳性率。

应用前景

基于MIRA的检测方法能够在恒温下快速扩增目标基因，特别是MIRA-LFD方法在短短10分钟内即可得到结果，无需复杂的实验设备，非常适合在养殖场等现场环境中使用。该技术的高灵敏度和高特异性使其成为一种高效的现场检测工具，有助于养殖者在早期发现和控制肝肠胞虫的传播，从而保护草虾养殖业的健康发展。